2019年。
作者：叶侃胡飞卫兆军。
单位：合肥工业大学生物学和食品技术学院。
叶侃安徽合肥硕士研究生研究方向：生物化学和分子生物学。 通信作者教授从事农业和林业特产功能食品加工和核生物功能基因的调节。
基金项目：国家自然科学基金项目(31301657)。
长期鉴定。
OSID开放的科学计划。
识别QR代码，听作者讲述论文的背景，并与同行交流他的经验。
大米大象(Sitophilusoryzae)是一种完全变态的昆虫。 它有四种发育形式的鸡蛋、幼虫、蛹、成虫，是贮藏谷物的主要害虫之一。 由于其地理分布在世界各地的快速生长和繁殖，对贮藏谷物的危害是严重的。 大米主要生长在我国南方。
核心生物具有多种谷胱甘肽转移酶(GST)的不同催化活性，以适应广泛的酶家族功能。 生物学具有精细的防御系统，以抵御外来和内部有害物质。 在该系统中，GSTS的作用是非常重要的。它经常在极端条件下具有抗氧化和解毒作用，以保护生物。 GST与农药抗性的关系对粮食害虫的防治具有重要的理论和实践意义。
本文对米象代谢解毒相关基因谷胱甘肽硫转移酶的表达进行了分析，从本质上说明了大米大象的磷化氢阻力。
材料和方法。
用于测试昆虫的治疗。
吃昆虫。
河南工业大学农产品储存实验室采集了不同种类的鸡蛋蛹成虫米状材料。
磷化氢的制备。
磷化氢是由磷化铝和10%稀硫酸反应产生的磷化氢浓度与木兰比色测定的。 磷化氢被注射到一个特殊的真空干燥器与密封注射器与害虫。
耐性测量。
使用联合国粮食及农业组织熏蒸20h(25°C)70%RH.. 从干燥器中取出处理的害虫，并将它们放置在病虫室中，以检查死亡率。
吃米饭的逆境。
不同浓度的磷化氢处理和不同的熏蒸时间。
数据处理。
使用SPSS软件进行分析和处理。
对大米图像转移组进行了分析。
通过SolexaRNA的paired-end测序，对每个测试样品进行测序，将最短的Reads片段从头到尾组装成转载组。 将已知功能蛋白的基因序列与数据库中已知功能蛋白的基因序列进行比较，以识别GSTS细胞色素P450和EST基因。
重症反应获得米象代谢解毒基因全长。
设计雷克引文。
根据上一步获得的大米新陈代谢解毒基因的中间片段，设计了5个RACE和3个RACE特异性引物，以扩大5个终点和3个终点的全长序列。 并预测长度。
合成5-RACE和3-RACE-READNA模板.
为了获得RACE-ReadycDNA模板，总共需要两个反应管来准备3-RACE-ReadycdNA合成反应系统。 每个管道都有10个μL反应系统。
大米新陈代谢解毒基因5/RACE和3/RACE扩大。
米象代谢解毒基因3‘RACE-ReadycDNA和5'RACE-ReadycDNA模板。 设计的PR3-F1和PR5-R1引物和通用引物UPM用高保真酶扩展..
顺序拼接。
5-RACE和3-RACE测序在NCBI数据库中进行序列比较，并与DNAMAN软件拼接.. 找到启动密码ATG和终止密码子TAA，在启动密码子和终端密码子中设计特殊的引物，以扩大米象代谢解毒基因的总长度。 胶水切割回收连接到PGEM-TeasyVector载体，然后选择阳性克隆和测序。
大米大象代谢解毒全长序列分析..
分析了大米13个GST基因序列与Primer5.0和DNAMAN软件。 分析大米新陈代谢解毒基因。
构建大米新陈代谢解毒基因系统进化树。
采用MEGA施工系统进化树，根据GSTSWANP450EST序列施工。
大米大象代谢解毒基因定量表达。
RNA泵提前处理。
在冰上解剖不同的熏蒸浓度和不同的熏蒸时间。大米大象分别是一个年龄、两个年龄、三个年龄、四个年龄的幼虫蛹。 解剖大米大象的不同组织：大脑（Head）表皮(Cuticle)、中肠(MG)、脂肪体(FB)、马管(MT)等3次。 每个样品包括五个单独的RNA提取步骤。
引物设计和识别引物质量。
设计荧光定量PCR引线，对四种样品进行荧光定量PCR反应，以检测这些基因的表达。
荧光定量PCR。
稀释样品CDNA采用荧光染料SYBRPremixExtaqII准备20μL反应系统在96孔板上加样。 在Bio-RADTWoColorReal-TimePC系列荧光系统荧光定量PC
结果和分析。
米象GSTS基因分离识别。
克隆获得了13个具体信息，如表1。 大米GSTS基因序列的总长度为811≤1209BP。编码氨基酸为202≤239分子量为23.19≤27.63kD.. 理论等电点为5.30~8.71..
根据序列的相似性和演变。 将六个基因归类为Epsilon家族（GSTE1GSTE3GSTE4GSTe5GSTE7GSTE8）。 这四个基因被归类为Sigma家族（GST1GST3GST4GST5）。 两个基因被归类为Theta家族（GSTT1GSTT2），另一个在Delta家族(GSTD1)(表2)。 爱普生家族基因间氨基酸的相似性为33.5~56.0%。西格玛家族基因之间氨基酸的相似性为44.7%~70.3%。 海塔家族基因间氨基酸的相似性为22.2%。
大米大象GSTS基因表达模式。
从图1可以看出。 SoGSTD1SoGSTE1和SoGSTE5基因经不同浓度(LC50LC30LC10)磷化氢熏蒸24小时后相对表达。 经LC30浓度磷化氢熏蒸24小时后，SOGSoGSoGSTT1基因的相对表达率明显高于其它2种浓度。 4个GSTS基因(SoGSTE3SoGSTE4SoGSTS1)和SoGSTS2)经LC50浓度磷化氢熏蒸24小时相对表现.. SoGSTE6SoGSTS3SoGSTT2基因在任何浓度磷化氢熏蒸24小时后明显低于控制组。
8个GSTS基因（SoGSTD1Sogste2Sogste3Sogste4Sogste4Sogste5Sogste5Sogste5Sogst 在熏蒸36小时后，相对表达的数量逐渐增加，然后开始下降。 SOGSte1基因在LC30磷化氢熏蒸48h后达到最大值。 SOGSTS2SOGSTT1基因在LC30磷化氢熏蒸12h后达到最大值，随后相对表达量开始下降。 经不同时期磷化氢熏蒸后，索GSTS3基因的相对表达率明显低于控制组(图1)。
图1磷化氢对13种GST基因诱导的剂量和时间效应。
如图2所示，大米，如Sigma家族GST基因。 SOGSTS1SOGSTS2和SOGSTS4基因在阶段均高于其他5个发育阶段。 索GSTS3基因在蛹期具有最高的相对表现。
SOGSTT1基因在蛹期和4龄幼虫阶段的相对表达率高于其他4个发育阶段。 SOGSTT2基因在成虫和蛹的相对表达方面优于其他4个发育阶段。
图2MI和13个GST基因在不同发育阶段的相对表达方式。
如图3所示。 大米大象13个GSTS基因中的11个（SoGSTD1SoGSTE1SoGSTE2SoGSTE3SoGSoGSTe4SoGSTE4SoGSTE SOGSTe6SoGSTS2和SOGSTT2基因在表皮中的相对表达是最低的。 只有SOGSTT1基因在米象的五个组织中没有显著的差异。
图3MI和13GST基因在不同组织中的相对表达方式。
结论和讨论。
克隆大米和GST基因的全长序列13。 将六个基因分类为Epsilon家族的四个基因，并将其归类为Sigma家族的两个基因。 它也被归类为Delta家族中的一个。 大米大象GSTS基因没有识别家庭的基因。
大米敏感剂是通过磷化氢熏蒸和不同时期的熏蒸而成的。 一般来说，GSTS的表达受熏蒸时间和剂量的影响，与时间和剂量有关。 总的来说，随着大米的生长和发展，GSTS的表达逐渐增加。
在不同的组织中，11个GST基因在中肠脂肪体或马管中的相对表达率明显高于头部和表皮。 大米大象GST基因成虫阶段的相对表达是四岁幼虫的第二种。
这项研究不仅发现了大米进化过程中的亲缘关系，而且进一步阐述了大米相关的抗药基因对抗昆虫的原理。 它为新药的发展提供了指导。 同时，大米图像遗传信息资源的扩大为大米图像转移小组今后的研究奠定了基础。 该研究选择了水稻大象中的GST基因进行系统分析，并假定了抗性基因数据库的建立，一方面可以研究昆虫之间的关系。 积极控制昆虫的耐药性，保持生态平衡。
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安徽农业科学。
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